GFP-Bakterier som proteinfabriker [labrapport i Biologi Breddnings kurs]

Inledning

Syftet med laborationen är att undersöka E. coli bakteriens förmåga att translatera GFP (Green Fluorescent Protein) genen som överförts med hjälp pGLO plasmider samt att undersöka kritiska steg i metoden. E. coli bakterien finns naturligt i våra tarmar och är viktig för matsmältningen.

Genen för GFP kommer ursprungligen från maneten Aequorea victoria. Genom klippning med restriktionsenzymer har denna gen i kombination med andra gener rekombinerats med en plasmid till att bli pGLO plasmiden. Man har utnyttjat MCS siter hos både plasmiden och gener samt olika restriktionsenzymer, dels för att klippa in men främst för att få en bestämd riktning hos replikationen av de insatta generna.

Plasmider är cirkulära DNA molekyler i bakterier - dessa är inte relaterade till bakteriernas cirkulära kromosomer, och innehåller ofta en eller flera gener vilka ger överlevnadsfördelar, exempelvis resistans mot antibiotika. I detta fall innehåller pGLO plasmiden en gen för β-laktamas vilket inaktiverar och därmed ger resistens mot ampicillin.

Bakterier kan vid olika tillfällen utbyta plasmider, och därigenom sprida överlevnadsfördelen, plasmiden kopieras då inom en bakterie för att sedan överföras till en annan bakterie där genen för resistans kan kopieras, transkriberas och sedan translateras. Ofta sker denna överförning då bakterien vistas i en livshotande miljö, exempelvis i en miljö där temperaturen är för hög. Olika plasmider har olika "replikations-tal" vilka anger hur mycket plasmiden kommer att replikeras inom bakterien, vektor-plasmider bör ha ett högt "replikations-tal" för spridning till andra bakterier samt transkription. Plasmider som används som vektorer måste därför innehålla en ORI site, där replikation kan ske.

För att transkription av en gen skall ske krävs det även närvaron av en promotor och en terminering sekvens i genen, där transkription kan initieras samt termineras. Dessutom måste RNA-polymeras finnas tillgängligt. Transkriptionen i en bakterie är ofta reglerad av ett operon vilket kräver ett inducerande ämne för att transkription skall ske, därför krävs det utöver promotor och terminerings sekvenser även inducerande ämne. Inte sällan är det inducerande ämnet i fråga ett ämne som skall kataboliseras, när allt inducerande ämne har brutits ner finns det således inget ämne kvar som stimulerar transkription, varvid transkriptionen avstannar. pGLO plasmidens produktion av arabinos reglerar transkriptionen av GFP - avsaknad av arabinos innebär att transkriptionen av GFP genen ej kan initieras. Mängden arabinos regleras i sin tur av arabinos operonet på ett sätt liknandes ovannämna operon. Produktionen av β-laktamas regleras enskilt av ett annat operon är arabinos operonet.

Lysosym är ett enzym som bryter ner cellmembran, och finns naturligt i vår tårvätska. TE buffert är en blandning av Tris samt EDTA med en funktion att skydda DNA/RNA genom att protolysera DNA/RNA blandningen till ett specifikt pH, ofta mellan pH 7.5 och pH 8.0. EDTA har dessutom förmågan att binda till metalliska joner som är viktiga för nukleasers funktion och därmed hämma nukleaserna.

Metod

Rekombinering av bakteriell DNA

Vardera 250 μl transformation solution tillsattes i två centrifugrör som sedan kyldes på is. Cirka 10 μl bakterier ur samma kolonier extraherades från en startplatta och blandades i vardera centrifugrör med hjälp av en ögla. Lösningen innehållandes pGLO plasmider undersöktes under UV bestrålning[1], varvid ungefär 10μl av pGLO plasmid lösningen tillsattes med en ögla i det ena centrifugröret. Rören lades åter på is under cirka 10 min.

Centrifugrören flyttades från isen till ett vattenbad med temperaturen 42°C, efter 50 sekunder i vattenbadet flyttades centrifugrören snabbt tillbaka till isen, där de inkuberades i 2 minuter. 250 μl LB tillväxtmedium pipetterades i de två centrifugrören som efter tillsatsen inkuberades i rumstemperatur i 10minuter. Centrifugrören undersöktes under UV ljus[2]. Vardera 100 μl ur centrifugröret innehållandes pGLO plasmider pipetterades på och spreds jämnt över en petriplatta innehållandes LB tillväxtmedium och ampicillin samt en petriplatta innehållandes LB tillväxtmedium, ampicillin och arabinos. Vardera 100 μl av bakterieblandningen ur det andra centrifugröret innehållandes endast bakterier pipetterades och spreds sedan jämnt över två petriplattor, den ena innehållandes endast LB tillväxt medel och den andra innehållandes detsamma plus ampicillin. Plattorna inkuberades upp-och-ner i 37°C. För resultat av inkubering, se diagram II i resultat sid. 3.

Tabell I. Tabell över inkubationsplattor och deras beting, +pGLO indikerar bakterier värmebehandlade med pGLO plasmider, - pGLO indikerar bakterier utan kontakt med pGLO plasmider.

Rening av GFP.

Plattorna +pGLO/LB/Ampicillin/Arabinos och +pGLO/LB/Ampicillin undersöktes under UV ljus[3] för att sedan räknas på antalet kolonier. En ögla (cirka 10 μl) av en koloni ur vardera bakterieodlingen (+pGLO/LB/Ampicillin/Arabinos och +pGLO/LB/Ampicillin) tillsattes i varsitt tillväxtrör (benämnda "+" samt "-") innehållandes LB/Ampicillin/Arabinos.

Tabell II. Tabell över överförning från petriplattor till tillväxtrör innehållandes LB/Ampicillin/Arabinos.

Tillväxtrören lades sedan på "shaker" och inkuberades i 32°C med LB/Ampicillin/Arabinos. Tillväxt rören inspekterades sedan i UV ljus[4].

2 ml av bakterieblandningen i tillväxtröret "+" överfördes till ett centrifugrör som sedan centrifugerades i 5 minuter i 14000 rpm. Efter centrifugering sögs supernatanten ut med hjälp av en pipett, kvarvarande pellet observerades under UV ljus[5]. 250 μl TE buffert blandades i bakterieblandningen, därefter tillsattes en droppe lysosym. Centrifugröret centrifugerades i 10 minuter i 14000 rpm, efteråt undersöktes röret under UV ljus[6]. 250 μl av supernatanten extraherades sedan försiktigt med hjälp av en pipett till ett nytt centrifugrör där 250 μl av binding-buffer pipetterades till.

Förberedelse av kolonn

Locket och pluggen på HIC kolonen avlägsnades så att bufferten i kolonen sipprade ut. 2 ml Equilibration buffert tillsattes i kolonnen och fick sippra tills 1 ml kvarstod varvid pluggen sattes fast.

Protein kromatografi     

Kolonen fästes över ett provrör så att kvarvarande 1ml Equilibration buffert sipprade ner i provröret. 250 μl av binding-buffer + supernatanten tillsattes i kolonnen. Sipprandet undersöktes under UV ljus[7]. När blandningen sipprat ut ersattes det fyllda provröret med ett nytt och 250 μl Wash-buffer tillsattes i kolonnen och fick sippra ut, processen undersöktes under UV ljus[8]. När allt sipprat ut ersattes det fyllda provröret med ett nytt och 750 μl TE buffert tillsattes i kolonen. Processen undersöktes under UV ljus[9].

Resultat

Antal kolonier i plattan "+pGLO/LB/Ampicillin/Arabinos": 1760

Transformationseffektivitet: 11220 se beräkningar i bilaga 

Diagram I. Tabell över observationer av de olika tillfällena vid belysning av UV-ljus.

Diagram II. Tabell över överlevnadsstatistik hos de olika petriplattorna efter inkubation.

Diskussion

Plasmiderna som bestrålades av UV ljus fluorescerade ej i grönt se resultat nr 1, diagram I sid. 3, plasmiderna i fråga hade inte utsatts för varken enzymer eller andra bakterier[10]. För att GFP skall kunna fluorescera måste det ha translaterats till ett protein. Vi kan dra slutsatsen att endast transkription och translation av GFP genen ger grönt fluorescerande ljus.

Efter att ha utsatts av ett värmebad på 42°C för att sedan snabbt kylts ner inkuberades E. coli sedan i LB tillväxtmedium[11]. Vi kunde konstatera i inledningen att "Bakterier kan vid olika tillfällen utbyta plasmider" samt att detta ofta sker "i en miljö där temperaturen är för hög" - Situationen är livshotande för bakterien. Bakterien som utsattes för 42°C vattenbad, E. coli, finns naturligt i våra tarmar där temperaturen konstant är kroppstemperatur, 37°C. Vid feber kan inre kroppstemperaturen nå 42°C det kan därför vara möjligt att 42°C är den extremaste temperatur som E. coli tål. Temperaturer över 42°C är livshotande för människor, varvid det skulle vara onödigt för E. coli att tåla temperaturer över 42°C. Utifrån dessa resonemang är det därför logiskt att den relativt höga temperaturen blev livshotande för bakterien som då, i de fallen där pGLO plasmiden var närvarande; tog upp denna plasmid.

Inget av centrifugrören fluorescerade grönt se resultat 2, diagram I sid. 3 direkt efter värmebadet [12], trots att ett rör innehöll plasmider med pGLO plasmiden. Bakterierna hade endast tillförts LB tillväxtmedium, men avsaknad av arabinos innebär att pGLO plasmiden ej kan transkriberas och translateras. Vi kan dra slutsatsen att närvaro av arabinos är essentiellt för att uttryck av GFP skall kunna ske.

Efter inkubation av bakterier i de olika betingen[13] visade resultaten se resultat efter inkubation, diagram II sid. 4 att bakterier med pGLO plasmiden överlevde, bakterier utan pGLO överlevde endast då ampicillin var frånvarande. pGLO plasmiden innehåller en gen för β-laktamas vilket ger resistens mot ampicillin. Bakterier som ej tagit upp eller kommit i kontakt med pGLO plasmiden kommer därför att sakna denna resistans mot ampicillin. Faktum att alla bakterier med pGLO plasmider samt att endast bakterier utan pGLO plasmid som ej utsattes för ampicillin överlevde tyder på att denna stam av E. coli ej är resistent mot ampicillin samt att upptagande av pGLO plasmiden ger resistans mot detsamma.

Plattorna +pGLO/LB/Ampicillin/Arabinos och +pGLO/LB/Ampicillin undersöktes under UV ljus se resultat nr 3, diagram I sid. 3, endast plattan +pGLO/LB/Ampicillin/Arabinos fluorescerade grönt. Skillnaden mellan plattorna var att den ena hade tillgång till arabinos. Observeration av tillväxtrören under UV ljus efter att de inkuberats i 32°C med LB/Ampicillin/Arabinos[14] visade att både "+" samt "-" fluorescerade grönt se resultat nr 4, diagram I sid. 3. Utifrån dessa resultat samt tidigare premiss att "närvaro av arabinos är essentiellt för att uttryck av GFP skall kunna ske" kan vi dra slutsatsen att premissen stämmer.

Efter centrifugering av bakterieblandningen i tillväxtröret[15] "+" visade UV bestrålning att pelleten fluorescerade grönt se resultat nr 5, diagram I sid. 3. Centrifugering och avlägsning av supernatanten innebar att man separerade bakterier från tillväxtmedium. Eftersom att pelleten fluorescerade grönt måste E. coli bakterierna innehålla GFP.

 Efter tillsatsen av TE buffert och lysosym samt centrifugering[16] visade supernatanten en grön fluorescerande färg vid bestrålning av UV-ljus, medan pelleten var ofärgad se resultat nr 6, diagram I sid. 3. Lysosym är ett enzym som bryter ner cellmembran och finns naturligt i vår tårvätska. Pelleten som bestod av E. coli bakterier innehållandes GFP kom i kontakt med lysosym och efter centrifugering var supernatanten grön, vilket påvisade GFP i supernatanten, samtidigt var pelleten ofärgad vilket innebär att det inte fanns någon betydelsefull mängd GFP i pelleten - GFP måste på något sätt ha transporterats ut genom cellmembranet. Lysosymets cellmembran nerbrytande roll tyder på att cellmembranet kollapsat så att GFP hamnat utanför. Centrifugeringen måste då ha separerat cellmembran samt andra bakteriella materia från GFP, lysosym samt TE buffert.

Efter genomgång av Equilibration buffert tillsattes supernatanten innehållandes TE buffert, binding buffert och GFP[17]. Det som sipprade ut fluorescerade ej se resultat nr 7, diagram I sid. 3, vilket tyder på att det som sipprade ut ej innehöll GFP. TE buffertens förmåga att påverka pH samt tillsatsen av Bindning buffert och Equilibration buffert tyder på att kolonnen fångat upp GFP[18]. Efter tillsats av Wash buffert[19] belystes det som sipprade ut med UV ljus och visade ej någon fluorescerande färg se resultat nr 8, diagram I sid. 3, det som sipprade ut hade ingen kontakt med någon av det föregående blandningarna. Detta tyder på att inget GFP som fanns bundet i kolonnen rann med ner. Vid tillsättning av TE buffert fluorescerade det som sipprade ut grönt se resultat nr 9, diagram I sid. 3. TE buffert tillsattes i supernatanten innehållandes GFP, eftersom att lika löser lika kan vi anta att TE bufferten som nu tillsattes "löste upp" och förde med sig GFP som bundit vid kolonnen.

Felkällor

Vid HIC kolonnen slutade wash bufferten att sippra, en luftbubbla upptäcktes vid mynningen av kolonnen. Efter uppsugning av luftbubblan med hjälp av en spruta förändrades inte situationen, kolonnen var igentäppt. Transformationseffektiviteten beräknades, och siffran 11220 erhölls, vanligtvis ligger transformationseffektiviteten mellan 800 och 7000, vi kan konstatera att inget gick snett vid detta steg. Ett kritiskt steg i extraheringen av GFP var uppsugningen av supernatanten innehållandes GFP och därmed separationen mellan cellmembran och GFP. Kolonnen verkade ha täppts igen, eftersom att GFP sögs upp från cellmembran och bakteriella beståndsdelar kan det vara möjligt att dessa följde med för att sedan täppa igen kolonnens filter.

Slutsats

Syftet med laborationen var att undersöka E. coli bakteriens förmåga att translatera GFP (Green Fluorescent Protein) genen som överförts med hjälp pGLO plasmider samt att undersöka kritiska steg i metoden. Vi kan dra slutsatsen att under de kritiska förutsättningar som E. coli utsattes för tar den upp pGLO plasmiden. Vi vet även att E. coli har förmågan att translatera GFP. Därutöver kan vi dra slutsatsen att samma plasmid som innehöll genen för GFP är essentiell för resistansen mot ampicillin. Vi kan även vara säkra på att närvaron av Arabinos är väsentlig för att GFP skall kunna uttryckas.

Bilaga

Beräkningar av Transformationseffektivitet: