Projektarbete om Aspergillus Fumigatus

KATEDRALSKOLAN

UPPSALA

2008-12-18

PROJEKTARBETESRAPPORT

ASPERGILLUS FUMIGATUS

Xingjian Su, NV3

1. Inledning                                               
1.1 Syfte och mål                                                          
1.2 Bakgrund                                                            
   1. A. Fumigatus                                                         
   2.Oxylipiders funktion och metabolisering hos A. Fumigatus samt nomenklatur      
och val av identifikationsmetoder         
   3. Masspektrometri (MS)                                                     
   4. Vätskekromatografi (HPLC)                                                                           
1.3 Val av betingelser utifrån syftet                                              
2. Materiel och Metod  
2.1 Materiel                                                                
2.2 Metod                                                                 
   1. Tillberedning av medier: Minimal Medium samt Malt extrakt                 
   2. Tillberedning av buffert pH = 8.0                                          
   3. Förberedelser av Svampen                                               
   4. Provförberedelser genom separation med hjälp av kromatografikolonnen "SepPak Cartrige"                                                            
   5. Identifikation/Behandling av kromatogram                                 
   6. Beräkning av resultatens säkerhet med hjälp av standardavvikelse               
3. Resultat                                                 
3.1 Resultat                                                               
3.2 Fragmentjonernas massor                                                 
3.3 Fragmentjonernas areor vid de fyra betingelserna                               
3.4 Statistik - Standardavvikelse proverna emellan                                 
4. Diskussion                                              
4.1 Tolkning av resultat                                                    
4.2 Felkällors uppkomst och påverkan                                          
4.3 Diskussion av sammansättningen av oxylipiderna förändring                    
   1. Trender angående 10R-HODE                                            
   2. Trender beträffande 8R-HODE                                          
   3. Trender angående 5S, 8R-DiHODE och 8R, 11S-DiHODE                   
4.4 Slutsats                                                          
5. Sammanfattning                                                                                                                         6. Referenser    

Bilaga  Sket jag i nu, dessutom finns inga bilder                                                                   

1. Inledning

1.1 Syfte och mål

Syftet med undersökningen är att ta reda på hur sammansättningen av de oxylipider som metaboliseras av Aspergillus Fumigatus förändras vid olika betingelser: temperatur samt tillväxtmedium. Målet är att identifiera oxylipider som påverkar A. Fumigatus för att ge bakgrund till forskning om de enzymer som metaboliserar dem. I slutändan är målet att hitta ett läkemedel mot A. Fumigatus.

1.2 Bakgrund

1. A. Fumigatus

A. Fumigatus är en patogen svamp som är vanligt förekommande i miljön omkring oss. Svampen orsakar "farmer's lung disease" - tröskdammslunga [1] och kväver värddjuret genom tillväxt efter att ha inandats i dess lungor. Under normala omständigheter bryter värddjurets immunförsvar ner svampen, men för individer vars immunförsvar är nedsatt, exempelvis är svampen livshotande för HIV smittade. A. Fumigatus och dess åtta släktingar tillhör svampfamiljen Ascomycetes, dessa kännetecknas av sina säckliknande strukturer, asci, i vilka den producerar sina sporer. Ascomycetes såsom A. Fumigatus producerar dess asci i ett så kallat ascocarp, motsvarande en fruktkropp [2] byggt i en mycelieliknande trådstruktur. A. Fumigatus utnyttjas även inom läkemedelsindustrin som modellorganism [3] och all information kring den kan därför vara av intresse.

2. Oxylipiders funktion och metabolisering hos A. Fumigatus samt nomenklatur och val av identifikationsmetoder

Oxylipider är oxiderade fettsyror och produceras av organismens enzymsystem och har en eller flera hydroxylgrupper bundna till molekylen. Oxylipider liknar eicosanoider: molekyler med 20 kolatomer med en signalerande förmåga inom centrala nervsystem och som därför spelar en viktig roll inom regleringmekanismer hos både ryggradslösa djur och ryggradsdjur [5]. Forskning har visat att oxylipider liksom eicosanoider spelar en viktig biologisk reglerande roll men hos svampar, deras funktion som signalsubstanser påverkar som sagt svampens regleringsmekanismer. Ett läkemedel skulle exempelvis fungera genom inaktivering av enzymer som främjar tillväxt.

Det är känt sedan tidigare att Aspergillus Fumigatus syntetiserar oxylipider ur linolsyra. Syntetiseringen sker i flertal steg [se figur 1 sid. 3]: Linolsyrans pro-S väte avlägsnas vilket leder till att linolsyran blir en fri radikal. Den fria radikalen kan sedan oxideras till 8R-HPODE eller 10R-HPODE [HPODE = Hydroperxyoctadecadienoic acid, HODE = Hydroxyoctadecadienoic acid]. Dessa två molekyler kan bilda monoxygenaser eller dioxygenaser - oxylipider med en eller två hydroxidgrupper. 8R-HPODE bildar oxylipider genom avlägsning av pro-S väte vid olika kolatomer. 10R-HPODE kan bilda oxylipider genom reduktion av peroxidgruppen. Siffrorna i namnen för oxylipiderna anger vilket/vilka kol som har hydroxylgrupper bundna till sig och de numeriska prefixen före HODE anger totala antalet hydroxylgrupper.

Att alla oxylipider innehåller hydroxidgrupper i olika antal och på olika platser kan utnyttjas vid identifikationen av oxylipiderna. Identifikationen kommer att ske med hjälp av masspektrometri och vätskekromatografi.

Figur 1: Schematisk figur över de steg involverade i syntetiseringen av oxylipider ur linolsyra. [4]

3. Masspektrometri (MS)

Masspektrometern joniserar molekyler och fragmenterar sedan dessa joner av en bestämd m/z (massa/laddning) kvot, exempelvis kan den programmeras att fragmentera allt som har m/z = 311

Tolkningen av resultatet baseras på fragmentjonerna: de fragment som bildas då masspektrometern fragmenterar jonerna. Enskilda molekyler med olika struktur och olika funktionella grupper har skilda och ofta karakteristiska fragmenteringsmönster, det vill säga fragmenten är olika molekylerna emellan. Detta innebär att det går att skilja på molekyler med samma molmassa om deras funktionella grupper är placerade på olika ställen. I denna undersökning kommer fragmentering att ske vid alla hydroxyl (OH-) grupper.

Det är de fyra molekylerna/oxylipiderna med m/z (molmassa/laddning) = 311 samt m/z = 295 [se figur 1] som kommer att undersökas.

4. Vätskekromatografi (HPLC)

Vätskekromatografi i denna undersökning var av typen HPLC - High Performance Liquid Chromatography. Kromatografen separerar ämnen utifrån polaritet. Testet förs in i ena änden av en kolonn där det finns en fast fas bestående av en kiselgel med C18 föreningar bundna till gelkornen. En rörlig fas av blandningen metanol, vatten samt ättiksyra pumpas genom kolonnen.

1.3 Val av betingelser utifrån syftet

Eftersom svampen smittar människor kommer vi att undersöka sammansättningen av metaboliterna vid 37 ? som ju är den inre kroppstemperaturen. En ökning av en eller flera oxylipiner vid denna temperatur skulle tyda på enzymen som syntetiserar dessa skulle uttryckas i högre grad vilket enligt 1.1 skulle vara av intresse vid framställning av eventuella läkemedel. Som referens till den inre kroppstemperaturen kommer den andra temperaturen att vara 22 ? vilket efterliknar rumstemperatur. Samma miljösimuleringar görs med tillväxtmedierna: När svampen når lungorna i värdorganismen hamnar den i en miljö med lite och få näringsämnen för den - detta simuleras med hjälp av Minimal Medium [6]. Som kontrast till detta fall kommer den andra betingelsen att vara 1.5 % Maltextrakt vilket innehåller väldigt höga halter av näringsämnen för svampen.

Tidigare forskning [4] har undersökt oxylipidsammansättningen men vid annorlunda betingelser. Även forskning kring Aspergillus Nidulans, en icke patogen släkting till Aspergillus Fumigatus har gett information om svampens metabolism [4].

2 Material och Metod

2.1 Materiel

Linolsyra (99 %) var från Merck. D-glukos, 20x nitratsalter, 1000x Trace elements, NaOH (1M samt 10M) samt Maltextrakt var från Sigma. 50ml Centrifuge rören och 10 ml rören var från Sarstedt. A. Fumigatus var en gåva från Dr. Levenfors (MASE laboratorier, Sveriges Lantbruksuniversitet, Uppsala, Sverige) Resten av lösningarna var av HPLC kvalitet och var från Merck and J. T. Baker Inc. Kolonner med C18 silikon och silikon (SepPak/C18 och respektive SepPak) var från Waters. Filtrerfilt var av märket Miracloth

HPLC och dess komponenter var av märket LTQ, Thermo Fisher Scientific, även masspektrometern var av märket Thermo Fisher Scientific. Evaporator samt päronkolvar var av märket Fischer Scientific.

2.2 Metod

1. Tillberedning av medier: Minimal Medium samt Malt extrakt

Minimal Medium: En bägare fylldes med H2O (≈620ml). D-glukos (7.00 gram), 20x nitratsalter (35.0 ml), 1000x Trace elements (700 μl) löstes i bägaren. pH värdet mättes sedan med en pH-meter, varvid NaOH (1M samt 10M) pipetterades i lösningen till lösningen hade pH = 6.5. Därefter fylldes bägaren med H2O tills lösningens volym var 700ml. Bägaren autoklaverades.

1.5% Maltextrakt: Maltextrakt (10.50 gram) löstes i 700ml H2O, bägaren autoklaverades sedan.

2. Tillberedning av buffert pH = 8.0

HCl (44.1 ml 0.1 M) löstes i en 100 ml bägare tillsammans med Na-borat (0.2 M) till lösningens volym var 100ml [Stamlösning, egentligen krävs endast 7ml till bufferten]. 7ml av lösningen överfördes till ett 10ml Sarstedt rör varvid 3.9μl Linolsyra tillsattes i lösningen. Lösningen fördelades om 0.5 ml i tolv 10 ml rör.

3. Förberedelser av Svampen.

I ett sterilrum fördelades sedan de två medierna i sex 50 ml rör om 30ml/rör, totalt tolv rör. Samtidigt i sterilrummet mixades A. Fumigatus tillsammans med H2O och fördelades om 1000 μl i de tolv 50ml rören innehållandes medier. Eftersom att proverna gjordes i trippel uppsättning placerades rören sedan i trippletter i olika betingelser under tre dygn [se nedanstående schema].

Schema över betingelserna. Olika medier och temperaturer undersöktes, Varje betingelse genomfördes i tripletter.

Efter tre dygn extraherades de bildade mycelierna enskilt ur vart och ett av rören med hjälp av en engångsplastspatel, mycelierna tvättades med hjälp av fysiologisk saltlösning (0.9% NaOH) och fördes sedan över till varsin av de tolv 10 ml rören innehållandes buffert. I fallen där för litet mycelium hade bildats för direkt extraktion med plastspatel filtrerades innehållet i rören genom Miracloth® i en tratt, därefter plockades myceliet upp av en plastspatel, tvättades med saltlösning (0.9% NaOH) och fördes därefter till en 10 ml rör med buffert.

Efter cirka fem timmar extraherades metaboliterna ur rören med buffert genom enskild filtrering medelst Miracloth® till varsin 10 ml glasrör. Därefter förbereddes varje prov för LC-MS genom Solid Phase Separation.

4. Provförberedelser genom separation med hjälp av kromatografi kolonnen "SepPak Cartrige"

SepPak kolonnen fästes vid änden av en glasspruta och 10 ml EtOH sprutades genom SepPak kolonnen för rengörning. 10 ml H2O sprutades genom SepPak kolonnen vilket aktiverade filtret i kolonnen, därefter sprutades provet genom kolonnen. 2 ml H2O sprutades genom kolonnen för rengörning. 5 ml Etylacetat tillsattes och sprutades genom kolonnen varvid elutatet uppsamlades i en päronkolv. Eluatet torkades sedan i en evaporator. Därefter tillsattes 1000 μl EtOH, varvid lösningen innehållandes prov fördes över till ett 11 ml koniskt rör. Lösningen torkades sedan med N2 (g). 40 μl MeOH tillsattes och provet/proverna sattes in i masspektrometern.

5. Identifikation/Behandling av kromatogram

Masspektrometer programmerades att jonisera molekylerna till envärt laddade joner. Detta innebar att förhållandet som masspektrumet visar mellan massa och laddning (m/z) är detsamma som molekyl- eller fragmentjonens molmassa. Vid x-axeln sattes molekylernas förekomst kronologiskt efter LC-datan, produkten blev en graf som efter integrering visade den relativa mängden molekyler i areaenheter [Se Figur 2 sid. 6]. LC apparaturen ifråga utnyttjade en mobil fas bestående av MeOH löst i vatten som pumpades genom en fast fas bestående av en C18-kolonn.

Figur 2: Kromatogram med y-axel = relativ förekomst (max 100 %) samt x-axel = tid. Gråa toppar integrerade.

Resultaten/arean i masspektrumet var fortfarande rådata i form av ovanstående kromatogram. Anledningen till att det klassades som rådata var för att mängden svamp inte kunde hållas konstant proverna sinsemellan och därför kunde inte proverna jämföras med varandra. Istället måste resultaten relateras proverna inbördes. Detta gjordes genom att dividera arean av intressemolekylen på en graf liknandes den ovan med summan av arean av de totalt fyra molekylerna. Därefter kunde resultaten behandlas som likvärdiga och infördes i tabeller.

6. Beräkning av resultatens säkerhet med hjälp av standardavvikelse

Standardavvikelse beräknas trippletterna emellan med hjälp av Microsoft Excel. Sedan beräknas standardavvikelsens procentandel av medelvärdet hos tripletterna.

3 Resultat

3.1 Resultat

Masspektrometern visade att fragmentjonernas massor var 213, 115, 157 och 183 g/mol [se nedanstående tabell]. Masspektrometern tillsammans med vätskekromatografen gav sedan resultat i form av kromatogram [se bilaga] där den relativa mängden fragmentjoner infördes i tabeller [se Fig. 3 - 6 sidorna 7 - 8]. Standardavvikelsen gav resultat mellan 2.37 och 89.8 % av medelvärdet [Se fig. 7 sid. 9]. 

3.2 Fragmentjonernas massor

Tabell över antalet okända molekyler/oxylipider som fragmenterats i masspektrometern.

3.3 Fragmentjonernas areor vid de fyra betingelserna

Figur 3: Stapeldiagram över medelvärdet av trippletternas area. Molekylen har molmassan 213 g/mol. [För alla grafer, se bilaga]

Figur 4: Stapeldiagram över medelvärdet av trippletternas area. Molekylen har molmassan 115 g/mol. [För alla areor, se bilaga]

Figur 5: Stapeldiagram över medelvärdet av trippletternas area. Molekylen har molmassan 157 g/mol.  [För alla areor, se bilaga]

Figur 6: Stapeldiagram över medelvärdet av trippletternas area. Molekylen har molmassan 183 g/mol.  [För alla areor, se bilaga]

3.4 Statistik - Standardavvikelse proverna emellan

Figur 7: Tabell över standardavvikelsernas andel av medelvärdet av tripletterna av oxylipiderna  8R, 11S-DiHODE, 5S, 8R-DiHODE, 8R-HODE och 10R-HODE

4 Diskussion

4.1 Tolkning av resultat

8R, 11S-DiHODE har en hydroxidgrupp vid C-8, vid beräkning visar det sig att fragmentjonen som bildas har molmassan 213 g/mol. 5S, 8R-DiHODE har en hydroxidgrupp vid C-5, den jon som bildas vid fragmentering har molmassan 115 g/mol. 8R-HODE har sin hydroxidgrupp vid C-8, fragmentjonen som bildas har molmassan 157 g/mol. 10R-HODE har sin hydroxidgrupp vid C-10, och bildar då en fragmentjon med molmassan 183 g/mol.

Fragmentjon 1 hade molmassan 213 g/mol, fragmentjon 2 115 g/mol, fragmentjon 3 157 g/mol och fragmentjon 4 hade molmassan 183 g/mol. Ur detta kan vi med enkelhet knyta oxylipider till okända fragmentjoner [se nedanstående tabell]:

Tabell över fragmentjonerna och deras molmassor som har knutits till specifika oxylipider.

4.2 Felkällors uppkomst och påverkan

När provet "37°C 1.5% Maltextrakt Aspergillus 2" [se schema över betingelser sid. 3] förbereddes för masspektrometer genomfördes Solid Phase Separation två gånger. SepPak kolonnens fasta fas separerar utifrån polaritet. I och med att första eluatet slängs innebär att när Solid Phase Separation genomförs två gånger med samma prov kan stora delar av provet gå förlorat då oxylipiderna inte fastnar i kolonnen på grund av att det är löst i elueringsmedlet. Felkällans påverkan på resultat kommer att visa sig i standardavvikelsen [se figur 7 sid. 8].

Tabellerna visar en hög standardavvikelse för resultaten av mätningarna på 8R, 11S-DiHODE och 5S, 8R-DiHODE. Även om standardavvikelsen för provet som gick fel är hög så är standardavvikelserna för de andra proverna även de väldigt höga. Alla resultat skulle alltså vara osäkra oberoende av felkällan. Det här är ett problem som uppstår när endast tripletter genomförs och omfattar alla betingelser oavsett standardavvikelse. För att få resultat som är relevanta bör fler prover göras.

Däremot kan det sägas att de två resterande oxylipidernas standardavvikelser är relativt låga med reservation av betingelserna med temperaturen 37°C hos 8R-HODE. Vid närmare undersökning av resultaten visar det sig att det är just provet som gick fel som varierar stort och förhöjt medelvärdet. Båda avvikelserna kommer att diskuteras i nästa avsnitt.

4.3 Diskussion av sammansättningen av oxylipiderna förändring

För att undersöka om rollerna av oxylipiderna sammanfattas fig. 3, 4, 5 och 6 till en tabell:

Figur 8: Stapeldiagram över hur sammansättningen av oxylipider förändras vid olika betingelser.

Svampen växer som sagt till i människans lu...