Enzymaktiviteten hos SUCCINATDEHYDROGENAS Vid olika betingelser

Enzymaktiviteten hos

SUCCINATDEHYDROGENAS

Vid olika betingelser

1 Inledning

1.1 Syfte

Syftet med laborationen är att undersöka och förklara hur enzymaktiviteten hos succinatdehydrogenas påverkas vid inkubation i olika betingelser: Förekomst av malonsyra och mängden natriumsuccinat. Dessutom kommer vi att undersöka vad som sker om jästcellerna som innehåller succinatdehydrogenaset kokas.     

1.2 Bakgrund

Enzymer är globulära proteiner som katalyserar reaktioner. Genom att binda substrat (reaktanter) som passar till enzymets aktiva centra som finns på enzymet; kan aktiveringsenergin för reaktionen sänkas.

Enzymers aktivitet beror dels på koncentrationen substrat, då mängden och därmed sannolikheten för bindning mellan enzym och substrat ökar och dels på mängden inhibitorer - ämnen som hämmar enzymaktiviteten. En typ av inhibitorer kallas kompetitiva inhibitorer, dessa konkurrerar med substratmolekylerna om att binda till samma aktiva centra. Aktiviteten beror alltså vid förekomst av kompetitiva inhibitorer på jämviktsförhållandet mellan dem och substratet: Ju högre koncentration substrat och lägre koncentration kompetitiv inhibitor, desto större chans att substratet binder och desto högre aktivitet, vice versa ger lägre aktivitet. Malonsyra är ett exempel på kompetitiv inhibitor och hämmar aktiviteten hos succinatdehydrogenas[1]. 

Enzymer kan ha olika specifitet gällandes vilket/vilka substrat som binder och hur väl dem binder, beroende på aktiva centrats tredimensionella utseende då substraten binder till centrat. Detta utseende eller rymdstruktur bestäms av kemiska bindningar och attraktioner mellan aminosyrorna som bygger upp enzymet. Attraktioner som förekommer är dipol-dipol, vätebindning, attraktion mellan positivt och negativt laddade grupper (ett slags jonbindning), van der Waalsbindning - främst den hydrofoba effekten samt disulfidbryggor som är starka kovalenta bindningar. Då aminosyrorna har specifika isoelektriska punkter kan en förändring i pH förändra laddningen hos aminosyran, och därmed bindningar och attraktioner vilka påverkar enzymets och dess aktiva centras rymdstruktur, vilket påverkar enzymaktiviteten. Förutom pH kan temperaturen påverka aktiviteten exempelvis då en hög temperatur medför att energi tillförs bindningar som då kan försvagas eller brytas. Enzymet kan då, precis som vid pH förändringar, denatureras - dess normala struktur förändras. Vissa enzymer kräver även coenzymer - en molekyl som ett enzym måste samverka med för att kunna katalysera en biokemisk reaktion.     

Succinatdehydrogenas är just ett sådant enzym och verkar i citronsyracykeln där den katalyserar oxidationen av succinat till fumarat genom avspjälkning av väte. Succinatdehydrogenas har coenzymet FAD[2] som tar upp väteatomer från substratet (succinat) och för det vidare till andningskedjan där vätet slutligen tillsammans med syre som väteacceptor bildar vatten. För vårat syfte kommer vi att utnyttja metylenblått istället för syre som väteacceptor. När metylenblått tar emot väte och reduceras går det över från sin blå till sin färglösa form. Reaktionen måste dock ske anaerobt eftersom luftens syre annars skulle oxidera metylenblått från redform till oxform, vi kommer därför att försegla provrör där reaktionen kommer att ske med hjälp av paraffinolja. 

2 Metod

Fyra engångsprovrör fylldes med olika kemikalier med hjälp av fyra olika automatpipetter med volymerna 100, 200, 300 samt 500μl, för att tillsätta volymen 400μl användes pipetten för 200 μl två gånger. Provrörens innehåll visas nedan i form av en tabell. Succinatdehydrogenas fanns i jästcellerna i jästsuspentionen och metylenblått tillsattes som coenzym. De fyra provrören förseglades sedan med hjälp av paraffinolja samt kork och inkuberades i 40°C vattenbad. Provrörens färg kontrollerades och eventuell avfärgning av innehållet i provrören nertecknades var femte minut under 60 min, därefter var 10 min under 20 min, totalt 80 min. Totalt kontrollerades engångsprovrören 15 gånger. Färgintensiteten hos den blåa färgen antecknades i en skala mellan tio (10) och noll (0) där tio är färgintensiteten från utgångsläget och noll helt ofärgad. Färgintensiteten anges utifrån en visuell bedömning.

Tabell 1: Tabell över engångsprovrörens kemikalieinnehåll, kemikalierna pipetterades i med hjälp av fyra automatpipetter med volymerna 100, 200, 300 och 500 μl. För 400μl användes pipetten för 200 μl två gånger. Provrören inkuberades i 40°C vattenbad.

3 Resultat

Det noterades att ingen blå färg uppkom innan tillsats av metylenblått.

Efter totalt fem minuter bedömdes färgintensiteten hos provrör "1" sjunkit från 10 till 6, resterande provrör var oförändrade. Efter totalt 10 minuter var provrör "1" helt ofärgad (0) och de resterande oförändrade. Vid 70 min efter start sjönk färgintensiteten hos provrör "3" från 10 till 8, de resterande provrören var oförändrade och ingen förändring hos något av provrören skedde efter denna kontroll. Resultaten redovisas på nästa sida i form av en tabell.

Tabell 2: Tabell över färgintensitetens förändring vid de kontroller som skedde var femte minut under 60 min och därefter var tionde minut under 20 minuter, totalt 80 min. Färgintensiteten anges i en skala mellan 10 - 0 där 10 är färgintensiteten vid utgångsläge och 0 är helt ofärgad. " anger oförändrad.

4 Diskussion

4.1 Diskussion

Den blåa färgen vid start av avläsning hos alla de fyra provrören med färgintensitet 10 är enbart och beror endast på färgen hos metylenblå, då den blåa färgen endast tillkom vid tillsats av metylenblått.

4.1.1 Påverkan från avjoniserat vatten

Det bör redan här nämnas att avjoniserat vatten i 40°C har Kw 3.1 · 10-14 vilket innebär att pH förändringen är så pass liten att den inte har någon nämnvärd effekt på enzymstrukturen och därför inte heller enzymaktiviteten.

4.1.2 Provrör 1

Vi ser i tabell 2 i resultaten att provrör "1" började avfärgas redan efter fem minuter, efter tio minuter var den helt ofärgad. För det första vet vi att det är metylenblått som är orsaken till den blåa färgen vid start. För det andra vet vi att metylenblått reduceras och blir avfärgat vid aktivitet hos succinatdehydrogenas och att provrör "1" innehåller just metylenblått samt succinatdehydrogenas (jästsuspention) och succinat (natriumsuccinat) som är dess substrat. Därför kan vi säga att det som skett är en reduktion av metylenblått genom att succinatdehydrogenas oxiderat succinat genom dehydrogenering. Det medför att succinatdehydrogenas i den betingelse som gäller i provrör "1" har en aktivitet. Vi kommer i fortsättningen att jämföra andra provrörs aktivitet med aktiviteten hos detta provrör.

4.1.3 Provrör 2

Provrör "2" avfärgades inte alls, vilket måste innebära att succinatdehydrogenaset i provröret ej haft någon aktivitet. Skillnaden mellan provrör "1" - där enzymet hade en aktivitet; och provrör "2" - där det inte skedde någon enzymaktivitet, är att provrör "2" istället för 500 μl hade 400μl vatten plus 100 μl malonsyra (0.4 M). Å ena sidan är det känt att syror påverkar pH vilket påverkar enzymaktiviteten då det påverkar enzymstrukturen genom att påverka bindningar och attraktioner mellan olika aminosyror i enzymet. Å andra sidan innehåller provröret fosfatbuffert (pH 7.4) med buffertegenskaper som därför borde avsevärt minska eller helt neutralisera effekten av en tillsatt syra och därför bör enzymaktivitet likvärdig den i provrör "1" kunna mätas, inaktiviteten måste bero på något annat. Teorin säger dock att malonsyra är en kompetitiv inhibitor och hämmar aktiviteten hos succinatdehydrogenas. Eftersom att inaktiviteten inte var på grund av en pH förändring eftersom att denna troligtvis aldrig skedde förklarar vi resultaten med att en kompetitiv inhibitor tillsatts. Likafullt kan vi bara dra slutsatsen att malonsyra är en inhibitor eftersom vi än så länge inte kan verifiera teorin att malonsyra är en kompetitiv inhibitor.  

4.1.4 Provrör 3

Provrör "3" avfärgades från 10 till 8 efter 70 minuter vilket är en mindre färgintensitetsminskning än provrör"1", dessutom har det tagit längre tid. Det här är något som innebär att succinatdehydrogenas i provrör "3" har en lägre aktivitet än provrör "1" men en högre aktivitet än provrör "2" som inte hade någon aktivitet alls. Innehållet i provrör "3" har istället för de 400 μl vatten som finns i provrör "2", 400 μl extra natriumsuccinat (tot. 500 μl). Båda har dock samma mängd malonsyra (100 μl: 0.4 M). Utan skillnaden i mängden natriumsuccinat bör vi därför ha förväntat oss samma resultat hos provrör "3" som "2": ingen aktivitet. Men vi kunde uppmäta en viss aktivitet vilket endast kan förklaras med att malonsyra är en kompetitiv inhibitor. Tillsatsen av natriumsuccinat innebar att jämvikten mellan substrat och inhibitor (malonsyra) förändrades så att koncentrationen substrat ökade vilket ledde till den ökade enzymaktiviteten i referens till provrör "2". Om malonsyra inte varit en kompetitiv inhibitor hade det inte blivit samma resultat utan resultat liknandes det från provrör "2". Därför bevisar och stärker resultatet teorin att malonsyra är en kompetitiv inhibitor.

4.1.5 Provrör 4

Provrör "4" har under laborationen inte visat någon enzymaktivitet i provröret. Till skillnad från provrör "1" och "3"som hade aktivitet var jästsuspentionen i provrör "4" kokt innan inkubation i kontrast till okokt hos "1" och "3". Eftersom att succinatdehydrogenaset kommer från jästcellerna måste skillnaden bero på att jästsuspentionen i provrör "4" var kokt. Vi känner till att temperaturen påverkar bindningarna mellan grupper i enzymet och därmed enzymets rymdstruktur och aktivitet. Eftersom att enzymet i prov...