Laborationsrapport i cellernas värld, biologi breddningskurs på Katedralskolan

Nedanstående innehåll är skapat av Mimers Brunns besökare. Kommentera arbete

Inledning
Syftet med laborationen är att kunna dra slutsatser om individers och folkgruppers släktskap och härkomst genom jämförelser i DNA-sekvenser.
Mitokondrier har sitt eget DNA som består av en DNA-molekyl i form av en ring. I människans mtDNA finns det 37 gener. mtDNA ärvs från mor till avkomma utan förändring, förutom slumpmässiga mutationer. Detta eftersom spermien lämnar sina mitokondrier utanför cellen vid befruktning.
Mitokondriegenomet består av 16569 baspar, varav ca.1200 baspar ingår i en icke kodande region.
Kontrollregionen är en del av det 1200 baspar långa ickekodande sekvensen i Mitokondriegenomet. Kontrollregionen kontrollerar DNA replikation samt RNA transkribtion. Mutationer i kontrollregionen sker relativt ofta, anledningen till detta är att regionen inte kodar för någon polypeptid. Sekvensen som sekvenseras är 440baspar långt.
Mutationer innefattar punktmutationer. Punktmutationer är mutationer som endast omfattar ett baspar. Det finns tre sorters punktmutationer: Substitution, insertion samt deletion, dessa punktmutationer kan få olika följder.
Datorns beräkningar tar dock hänsyn till detta.
Ju längre tid som har förflutit sedan individerna hade en gemensam förfader desto fler skillnader hittar man då man jämför sekvenser från deras Mt-DNA. Genom att sekvensera en bestämd ickekodande sekvens hos olika individers Mt-DNA, och sedan jämföra resultaten; kan man utifrån jämförelsen fastställa dessa sekvensers släktskap.
Varje cell innehåller runt 1000 kopior av mtDNA. Därför används mtDNA ofta för att utröna släktskap mellan olika organismer och individer då det finns lite eller gammalt DNA.
25 % av baserna stämmer alltid överens av rena sannolikhetsskäl.
Geners stamträd är inte alltid detsamma som arters stamträd. Sekvensers släktskap ger inte en helhetsbild av arters/individers släktskap.
Samma sak gäller vid släktbestämning genom mtDNA. För att få en helhetlig bild av släktskapet mellan individer krävs det att man utöver mtDNA även jämför kärn-DNA. För att tolka släktskap på ett säkert sätt krävs därför jämförelse av flertal av individernas gener.
Skillnader uppstår hos individer i specifika folkgrupper. Även om individerna ingår i samma folkgrupp finns det inbördes skillnader i individernas sekvenser.
PCR är en metod där en önskad sekvens kan masskopieras i en metod liknande DNA replikation. PCR processen involverar tre huvudsteg: Denaturering, Hybridisering samt Polymerisation.
Gelektrofores är en metod där sekvensers längder framgår i en mätbar längd på gelen. Vid användandet av en sekvens där längden i baser samt längden i mätbar längd är känd kan sekvensen i undersökningen längd i baser mätas. En sekvens där längden i baser samt längden i mätbar längd är känd kallas Stege.



Metod

Extraktion av DNA och masskopiering av mtDNA med PCR
1000μl cellsuspension (Kindceller + saltlösning)
↓
Centrifugeras → supernatant
Pellet +lite saltlösning
↓
100μl Chelex, skakas
↓
Inkubera i 99°C (10 minuter)
↓
Centrifugeras → pellet + överflödig supernatant
30μl supernatant
↓
PCR mix + 5μl supernatant
↓
40 cykler PCR cykel



Rening av DNA
GenElute Miniprep Binding Column + 500μl Column Preparation Solution
↓
Centrifugering (1min) → eluat
↓
30μl DNA + 150μl Binding Solution, skakas
↓
Uppsamlings rör
↓
Centrifugering (1min) → eluat
+500μl Wash Solution
↓
Centrifugering (1min) → eluat
Centrifugering (2min) → eluat + uppsamlings rör
↓
Nytt uppsamlings rör + kolonn + 50μl Elution Solution
↓
Inkubering (1min rumstemp).
↓
Centrifugering (1min)
12μl Centrifugat/DNA-prov + 3μl primer 1 + 3μl vatten
↓
PCR-rör
↓
Fryses in
↓
Sekvensering Rudbeck



Gjutning av gel samt gelelektrofores.
35ml agaroslösning (i Vattenbad 60°C)
Gelgjutningsform + kam
(Stelna i 20min)
↓
Gelplatta + 0.25 X TBE-buffert + elektroforeskärl → kam
↓
20μl Stege + 20μl DNA prov + 20μl • 6st Karamellfärg
↓
Gelelektrofores (200V, 30min)

Infärgning av DNA
Gelplatta + gel → Gelplatta
↓
Gel + 0,0025 % Metylblått + 0.1x TBE
↓
Kylskåp


Resultat
Mitokondrie sekvens ”Oscar”, otrimmad med osäkra baser i ändarna:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGGAANNAGANTTGGNTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACANCCNCTATGTATTNCNNACATTACTGCCAGCCACCATGAATANTGTNCANNACCATAAATANTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACNCAACCCACATCAAAACCCCCTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCTTCAACTATCACACNTCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCACTANGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGNACATAGCANATAAAGCCATTNACCGTACANAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCCTCANATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCTN

Mitokondrie sekvens ”Oscar”, trimmad utan osäkra baser i ändarna:
CCAAGTATTGACTCACCCATCAACANCCNCTATGTATTNCNNACATTACTGCCAGCCACCATGAATANTGTNCANNACCATAAATANTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACNCAACCCACATCAAAACCCCCTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCTTCAACTATCACACNTCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCACTANGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGNACATAGCANATAAAGCCATTNACCGTACANAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCCTCANATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCT


Tabell över antalet skillnader i baser mellan individer, alla sekvenser är trimmade i ändarna. Se fullständiga jämförelser i bilaga.
Norrman Tysk Spanjor Isman Neanderthalare
Oscar 2 4 0 4 15 Antal skillnader i baspar



Cladogram samt Phenogram med olika längder ritas upp med hjälp av datorn.:

Cladogram med olika längder, alla sekvenser trimmade i ändarna:


Phenogram med olika längder, alla sekvenser trimmade i ändarna:



Figur av gel efter gelelektrofores:



Diskussion
Följande iakttagelser dokumenteras utifrån resultaten då den trimmade sekvensen ”Oscar” jämförs med motsvarande sekvens hos Norrman, Tysk, Spanjor, Isman samt Neanderthalare:


Tabell över när (antalet baser efter start) skillnader i baser inträffar i sekvensen mtDNA mellan Oscar och Tysk. För tabell över alla individer, se bilaga.
Oscar/tysk
Skillnad nr: Antal baspar efter start
1 73
2 116
3 167
4 255



Tabell över när (antalet baser efter start) skillnader i baser inträffar i sekvensen mtDNA mellan Oscar och Isman.
Oscar/Isman
Skillnad nr: Antal baspar efter start
1 73
2 116
3 167
4 255


Tabell över antal osäkra baser (N) vid jämförelse av mtDNA sekvens:
Norrman Tysk Spanjor Isman Neanderthalare
Oscar 15 15 15 18 8 Antal osäkra baser



Vid jämförelse av mtDNA sekvenser mellan Oscar och Neanderthalare finns det femton skillnader i baspar: Antalet skillnader i baspar är 15.
Vid jämförelse av mtDNA sekvenser mellan Oscar och Isman finns det fyra skillnader i baspar: Antalet skillnader i baspar är 4.
Vid jämförelse av mtDNA sekvenser mellan Oscar och Tysk finns det fyra skillnader i baspar: Antalet skillnader i baspar är 4.
Vid jämförelse av mtDNA sekvenser mellan Oscar och Norrman finns det två skillnader i baspar: Antal skillnader i baspar är 2.
Vid jämförelse av mtDNA sekvenser mellan Oscar och Spanjor finns det inga skillnader: Antalet skillnader i baspar är 0.

Skillnader i sekvenser mtDNA mellan Oscar och Neanderthalare är flest. Cladogram samt Phenogram visar att sekvensen mtDNA hos Neanderthalare är minst släkt med motsvarande sekvens mtDNA hos Oscar.
Genom att tolka dessa observationer kan man dra slutsatsen att sekvensen mtDNA hos Oscar är minst närbesläktad med motsvarande sekvens mtDNA hos Neanderthalare.

Skillnaden i antal baspar i sekvensen mtDNA är fyra mellan ”Oscar” och ”Isman”, även samma antal baspar skiljer mellan sekvenserna ”Oscar” och ”Tysk”. Tabellerna som visar när (antalet baser efter start) skillnaderna inträffar visar att alla fyra skillnader i baser sker på samma punkt hos Tysken samt Ismannen i jämförelse med Oscar.
Cladogram samt Phenogram visar att sekvens mtDNA ”Oscar” är lika mycket släkt med Tysk som han är med Isman.
Utifrån dessa observationer dras slutsatsen att släktförhållandet i sekvenser mtDNA mellan Oscar och Tysk är exakt samma förhållande i samma sekvenser mtDNA mellan Oscar och Isman: Sekvens mtDNA ”Oscar” är lika mycket släkt med sekvens mtDNA ”Tysk” som den är med sekvens mtDNA ”Isman”.

Tabellen över antalet skillnader i baser mellan individer samt tidigare konstaterande leder till slutsatsen att sekvens mtDNA ”Oscar” är mer släkt med motsvarande sekvens mtDNA ”Tysk” och ”Isman” än med ”Neanderthalare”.

Skillnaden i antal baspar i sekvensen mtDNA är två mellan Oscar och Norrman.
Tabellen över antalet skillnader i baser mellan individer samt Cladogram och Phenogram visar att sekvens mtDNA ”Oscar” är mer släkt med motsvarande sekvens mtDNA Norrman än ”Tysk” och ”Isman”.
Slutsatsen är att sekvens mtDNA ”Oscar” är mer närbesläktad med motsvarande sekvens ”Norrman” än motsvarande sekvenser ”Tysk”, ”Isman” samt ”Neanderthalare”.

Skillnaden i antal baspar i sekvensen mtDNA är noll mellan Oscar och Spanjor.
Cladogram samt Phenogram visar att sekvensen mtDNA ”Oscar” och ”Spanjor” delar samma stamfader. Avståndet till närmaste stamfader är minst mellan ”Oscar” och ”Spanjor”.
Första konstaterande tyder på att sekvensen mtDNA ”Oscar” är detsamma som motsvarande sekvens ”Spanjor”.
Slutsatsen är att sekvensen mtDNA ”Oscar” är mest släkt med Spanjor.

Det konstaterades i inledningen att ”geners stamträd är inte alltid detsamma som arters stamträd”. ”Sekvensers släktskap ger inte en helhetsbild av arters/individers släktskap. Det konstaterade även att samma sak gällde för mtDNA samt att ”för att tolka släktskap på ett säkert sätt krävs därför jämförelse av flertal av individernas gener”.
Detta leder till slutsatsen att de slutsatser som konstaterats endast gäller för den specifika sekvensen mtDNA som sekvenserades. Slutsatserna säger väldigt lite om släktskapet mellan individer som helhet, endast släktskap mellan specifika sekvensen mtDNA kan fastställas.
Resultaten visar att ett antal osäkra baser finns vid alla jämförelser. Osäkra baser kan vara antingen likheter eller skillnader. Antalet osäkra baser påverkar trovärdigheten hos jämförelsen. Såsom det konstaterades i inledningen kommer även 25 % av baserna att stämma överens av sannolikhetsskäl, detta hämmar också resultatens trovärdighet.
I inledningen konstaterades det att ”skillnader uppstår hos individer i specifika folkgrupper. Även om individerna ingår i samma folkgrupp finns det inbördes skillnader i individernas sekvenser”. Sekvenserna mtDNA för Norrman, Tysk, Spanjor, Isman samt Neanderthalare är därför endast specifika sekvenser för just dessa individer. Det är inte omöjligt att dessa individer har flertal skillnader som skiljer de från sina respektive folkgrupper. Det går alltså inte ur denna synpunkt att genomföra en trovärdig släktbestämning mellan Oscar samt de andra individerna.

Slutsatsen är: Sekvensen mtDNA ”Oscar” är släkt med motsvarande sekvens ”Norrman”, ”Tysk”, ”Spanjor”, ”Isman” samt ”Neanderthalare” i följande ordning:
Tabell över släktskap, avtagande släktskap till vänster.
Neanderthalare Isman/tysk Norrman Spanjor
Oscar 15 4 2 0 Antal skillnader

Felkällor
Gelelektroforesen visade ingen markör för mtDNA sekvensen. Stegen (D...