Labrapport Lysoym

1. Inledning

1.1 Syfte

Syftet med laborationen är att rena fram lysozym från hönsäggvita, påvisa och mäta enzymets aktivitet, bestämma dess molekylvikt; samt identifiera några andra hönsäggviteproteiner.

1.2 Bakgrund och val av undersökningsmetoder

Lysozym är ett enzym som verkar på bakteriers cellväggar genom att hydrolysera glykosidbindningarna mellan kolhydraterna i cellväggen. Enzymet finns därför i tårvätska som ett preliminärt skydd mot bakterieinfektioner, det finns även i vårt blod med samma funktion. Lysozym har en isoelektrisk punkt kring 10 [1] och är vid pH 7 negativt laddad. Lysozym som finns i hönsäggvita har syftet att skydda de näringsrika ämnena ämnade för kycklingens utveckling - det är sådant lysozym som kommer att undersökas. Hönsäggvita innehåller förutom lysozym en rad andra proteiner, något som vi måste ta i hänsyn till vid aktivitetsbestämning. För våra syften har vi valt jonbyteskromatografi sammankopplad med en fraktionssamlare för proteinseparation. För aktivitetsbestämning kommer spektrofotometri att utnyttjas och för proteinidentifikation av utvunnen proteinlösning kommer vi att använda oss av metoden SDS-PAGE.

1.3 Undersökningsmetoder

1 Jonbyteskromatografi

För separation av protein från äggvita kommer katjonbyteskromatografi att användas då lysozymets isoelektriska punkt är över 7.0. Proteiner kommer först att binda till den fasta fasen - vi kommer sedan att eluera med en buffert vars salthalt graduellt ökas. Saltets negativa joner kommer att konkurrera med proteinerna om att binda till den fasta fasen. Denna konkurrens är en jämnvikt där förhållandet mellan proteiner och salt som sköljs ner beror på salthalten. Hönsäggvita innehåller många olika proteiner varvid vi förväntar oss att olika proteiner kommer att elueras vid olika salthalter.

2 Fraktionssamlare

Genom att koppla samman jonbyteskromatografin med en fraktionssamlare blir det möjligt att ta vara på lösningar innehållandes proteiner. Fraktionssamlaren samlar upp fraktioner under en reglerad tid i olika provrör. Maskinen kopplas till en dator där en viss proteinkoncentration kommer att ge ett motsvarande spänningsutslag som en funktion av tiden. Utifrån kända standardkoncentrationer av BSA (Bovint Serum Albumin) kan en standardkurva där koncentration är en funktion av spänning uträknas för att ange fraktionssamlardata i koncentrationsenheter. Vi är i vårt fall intresserade av en hög koncentration. Med denna utgångspunkt kommer data avläsas och tidpunkter för hög koncentration samt i vilka provrör som de finns i anges.

3 Spektrofotometri

För att skilja proteinlösningarna åt och välja den med högst koncentration lysosym har vi valt spektrofotometri. Vid blandning av bakterier (i detta fall micrococcusbakterier) med proteinlösning kommer eventuell lysosymaktivitet att lysera bakterierna. Blandningen går då från grumlig till genomskinlig - något som kan mätas med hjälp av en spektrofotometer som anger absorbans i form av spänningsutslag. Om tidräkning sker kan absorbansen beräknas som en funktion av tiden, funktionen visas på en dator. Hög aktivitet kommer därför att ge en graf som stiger snabbt. Eftersom att syftet var att rena fram lysosym medför det att vi är intresserade av den funktion som stiger snabbast. Derivatan för funktionen där andraderivatan < 0 anger reaktionshastigheten i minsknings i optisk densitet/sekund.

4 SDS-PAGE

Efter aktivitetsbestämning av proteinlösning kommer SDS-PAGE att genomföras med syfte att identifiera olika proteiner och lysozymets molekylvikt. Låg molekylvikt innebär längre avlagd sträcka i gelen. Förutom tillsats av SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) för att försumma proteinets specifika laddning tillätts även TCEP (Tris (2-CarboxyEtyl) Phosfin hydrocloride) för brytning av disulfidbryggor. För stege med kända molekylvikter har vi valt stegen LMW (Low Molecular Weight marker), Separationen genomförs med Pharmacia Phast System.

2. Metod

För Metod, se [4] Hansson. M, Laborationer och övningar i kemi breddning - biokemi, 2008-11-11 Katedralskolan - Uppsala

3 Resultat

3.1 Jonbyteskromatografi och fraktionsmätare

Vid mätning av kända protein- (BSA) -koncentrationer erhölls en tabell med koncentrationer och spänningsvärden. Tabellen visas också i form av en graf där koncentrationen är en funktion av spänningen.

En graf med spänning som en funktion av tiden erhölls vid kromatografi av hönsäggvita, fraktionssamlaren inställdes på 60 sekunder/rör. Rör av intresse är nummer 10, 11 samt 40, 41, 42 och anges på grafen.

Tabell över BSA koncentrationer mätt i gram/liter och spänning mätt i volt.

Standardkurva för BSA-koncentrationer mätt i gram/liter och spänning mätt i volt.

Graf över spänning som en funktion av tiden uppmätt vid fraktionssamlaren, toppar av intresse markerade.

3.2 Spektrofotometri

Spektrofotometri visade att topp nummer 41 gav en graf som steg snabbast och därför hade högst enzymaktivitet. Tidpunkt vid rör 41 är 41 multiplicerat med 60 = 2460. Avläsning av ovanstående graf ger spänningen 0.25 V vid t = 2460.

Beräkning av proteinkoncentration ur funktion erhållen från standardkurvan (Se «3.1 Jonbyteskromatografi och fraktionsmätare»):

Om f(x) = 6.3568x - 0.0899 är f(0.25) = 1.4993 gram/liter

3.3 SDS-PAGE

SDS-PAGE genomfördes och en bild av den togs. Gelen genomfördes tillsammans med en annan laborationsgrupp, brunnar av intresse är därför markerade med dess innehåll. LMW stegens innehåll presenteras i from av en tabell.

Bild av gel från SDS-PAGE. Brunnar av Intresse markerade och avgränsade från andra brunnar.
Fr. V till Hö: Lysozymlösning, Fraktion Nr 41, Äggvita samt Stege LMW.

Tabell över ingående proteiner i LMW (Low Molecular Weight Marker) stegen.

4 Diskussion

4.1 Jonbyteskromatografi med Fraktionssamlare

Jonbyteskromatografin med fraktionssamlaren visade två tydliga toppar där spänningen var hög. Eftersom att lysosym inte nödvändigtvis finns röret vid extrempunkterna hos topparna sparades även omkringliggande rör för vidare test i spektrofotometri. Innan kromatografin begicks ett fel då buffert innehållandes salt blandades med äggvitan. Detta medför att lysozymet vid kromatografi redan från start kommer att konkurrera med saltets negativa joner. Resultatet är att en viss mängd lysozym kommer att förloras i de tidigare rören och att koncentrationen lysozym i de angivna rören blir lägre. Detta medför en lägre aktivitet och koncentration.

4.2 Spektrofotometri

Eftersom jonbyteskromatografi endast separerade protein med lösning använde vi oss av spektrofotometri för att isolera lysozym. Vid test av provrör som innehöll protein av intresse fann vi att provrör 41 hade högst aktivitet. Provrör 41 hade en proteinkoncentration på 1.4993gram/liter. Vi kan inte med säkerhet säga att detta är koncentrationen för lysozym då det är möjligt att andra proteiner har liknande bindningsstyrka till den fasta fasen som lysozym. Vi förväntar oss att lysozymkoncentrationen är högre i äggvita p.g.a. felkälla (Se ovan). Spektrofotometridata gick förlorad under laborationens gång, därför kan ingen aktivitet anges i siffror.

4.3 SDS-PAGE

1. Felkälla

Vi använde en LMW stege med kända molekylvikter vid SDS-PAGE för molekylviktsbestämning. Bilden i resultatet (se «3.3 SDS-PAGE») visar en brunn som långtifrån liknar en normal bild på en LMW stege.

Vid SDS-PAGE misslyckades första gelen varvid en sekundär gel användes. I följandes andra gelen hann proverna torka innan den kördes, därför återfylldes brunnarna - Det är osäkert om brunnen med stegen återfylldes. Första felet innebär föga felkälla men uttorkningen och främst att den ej påfylldes kan möjligtvis förklara den misslyckade stegen. Vi kommer därför i fortsatt diskussion att referera till den andra laborationsgruppens LMW stege. Samma bild kommer att användas och visas nästa sida.

Bild av gel från SDS-PAGE. Brunnar av Intresse markerade. Stege LMW resultat från annan laborationsgrupp. Fr. V till Hö: Lysozymlösning, Fraktion Nr 41, Äggvita samt Stege LMW

2. Stegen

Aprotinin med molekylvikten 6500 finns ej med i bilden på stegen [2], den stryks därför från tabellen över proteiner i LMW (Se «1.3 Undersökningsmetoder - 4 SDS-PAGE»). Nedan visas en bild på gel med några av stegens steg utskrivna.

Tabell över ingående proteiner i LMW (Low Molecular Weight Marker) stegen exklusive Aprotinin.

Bild av gel från SDS-PAGE. Brunnar av Intresse markerade, även några möjliga proteiner ur stegen markerade.

3. Fraktion nr 41 jämförd med Stege

Brunnen med fraktion nr 41 visar en tydlig linje i höjd med α-laktalbumin (se «4.3 SDS-PAGE») - ett protein som har en primärstruktur väldigt lik lysozym: «The sequence comparison of αα-lactalbumin shows a strong similarity to that of lysozymes.» [3] Dessutom dominerar α-laktalbumin i komjölk varför det vore konstigt om den fanns i hönsäggvita. För övrigt har kromatografi redan skett, något som innebär att en viss sortering av proteiner utifrån isoelektriska egenskaper redan skett. Logiskt sett bör därför linjen vara Lysosym. Eftersom att lysozymets primärstruktur är väldigt lik α-laktalbuminets vars molekylvikt är 14200 gram/mol, är lysozymets molekylvikt också runt 14200 gram/mol.

4. Lysozymlösning jämförd med Stege

Bilden på brunnen med lysozymlösning visar att den troligtvis har misslyckats. På grund av uttorkning. (Se «4.3 SDS-PAGE - 1. Felkälla»)

5. Äggvita jämförd med Stege

Brunnen med äggvita visar att äggvita innehåller en rad olika proteiner. Eftersom att alla linjer i LMW stegen representeras i brunnen med äggvita kommer vi utifrån tabellen över proteinerna i LMW diskutera äggvitans proteininnehåll.

Ovalbumin samt Ovomucoid finns i ägg [3], ovomucoid är en trypsin inhibitor [3]. Trypsin inhibitor i sojaböna bör inte skilja sig nämnvärt i primärstruktur från trypsin inhibitor i äggvita då de är...