PCR

Nedanstående innehåll är skapat av Mimers Brunns besökare. Kommentera arbete

Vem uppfann PCR-tekniken?

Kary B. Mullis år 1983 när han satt och funderade under en biltur. Det finns dock de som hävdar att Mullis endast kom på det sista steget och inte ska ta all ära eftersom flera forskare har varit med och tagit fram de olika delstegen som sedan Mullis lyckades pussla ihop till PCR. Det var han som systematiskt provade fram de olika temperaturerna och tiderna och slutligen fick fram den mest lämpade miljön för metoden. Upptäckten gav honom Nobelpriset i kemi 1993.


Vad går tekniken ut på?

Att kopiera DNA, bitar/strängar ur DNA.


Inom vilka områden används PCR?

Inom forskning som undersöker DNA och dess egenskaper och spåra gamla sjukdomars ursprung och vad de kan bero på. Inom det kriminaltekniska. Förr om man hade en bloddroppe kunde man enbart jämföra dess DNA med en misstänkt. Men nu när man kan masskopiera DNA kan flera misstänkta kollas. Med hjälp av den här metoden har man nu också påbörjat att sätta ihop alla delar av Dödahavsrullarna. Man skrev nämligen på hud från getter och gaseller och da kan man identifiera vilka olika djur de kom ifrån och då puzzla ihop de 10 000 olika bitar som finns.
PCR har visat sig mycket användbar inom många områden, t ex i medicinsk behandling och rättsmedicin och djurforskning har dragit nytta av tekniken.

Den största fördelen som har erhållits med PCR är möjligheten att få fram stora mängder DNA från ytterst lite ursprungligt DNA. Detta har bland annat underlättat för rättsmedicinska undersökningar. Vid brottsplatser hittar man kanske ett hårstrå eller lite saliv, men inte tillräckligt för att kunna analysera DNA direkt genom t ex gelelektrofores. Men med hjälp av PCR kan man nu kopiera upp så stora mängder DNA så att en analys kan göras och därmed binda en misstänkt vid brottet.

Även inom den medicinska världen har PCR underlättat forskarnas vardag. Speciellt när det gäller identifiering av sjukdomsframkallande organismer och identifiering av ändringar eller mutationer i gener (med betoning på mänskliga gener). Tittar man endast på en cell, vilket är möjligt med hjälp av PCR, kan man se mutationer snabbare och härleda dem arvsmässigt. Det har även visat sig enkelt att analysera sjukdomsframkallande organismer som tidigare var omöjliga att analysera för att de inte gick att odla på agarplattor eller i något annat medium. Med PCR kan man genom sekvensering få reda på organismens genom och sedan analysera fram vilken gen som orsakar sjukdomen. Personer som har ärftliga sjukdomar i släkten kan, om sjukdomsgenen är känd, få sitt genom kontrollerat för att få reda på om de har sjukdomen eller inte.


Vad står PCR för?

Polymeras Chain Reaction. (Polymeras Kedje Reaktion)


Hur många steg sker PCR i och vad heter dem?

Den sker i 3 steg, denaturering, hybridization och extension.


Vad behövs till en PCR reaktion?

Först och främst det aktuella DNA:t som ska kopieras, primers, nukleotider och ett kopieringenzym (polymeraset).


Vad är ett polymeras?

Ett polymeras är ett naturligt förekommande enzym som finns i alla levande organismer. Dess uppgift är att katalysera reaktionen som skapar nytt eller reparerar DNA (i vissa fall även RNA). Denna reaktion har vi människor lärt oss att stoppa och starta genom att reglera temperaturen i miljön som enzymet arbetar i.


Vad består en primer av?

Primern är en enkelsträngad DNA-sekvens bestående av 15 – 20 baspar sammankopplade.


Vilken uppgift har kopieringsenzymet?

Dess uppgift är att plocka in nukleotiderna på rätt ställe. (ofta används enzymet Taq som tål hög temp)


Varför polymeraset Taq?

Från början, när tekniken var ny, använde man sig av ett polymeras från bakterien E. coli. Detta var inte särskilt effektivt eftersom denatureringssteget, på grund av sin höga temperatur, inaktiverade polymeraset och nytt polymeras måste tillsättas i varje cykel, en mycket tidsödande metod. Man studerade bakterier som levde i varma källor med temperaturer runt 100 °C och fann en bakterie som frodades i dessa temperaturer, Thermus aquaticus. Från bakterien renades Taq polymeraset fram som utan svårigheter klarade denatureringssteget på 95 °C och var lika effektivt under alla cykler. Genom denna upptäckt lyckades man förenkla hela PCR genom att det tidsödande steget med att tillföra nytt polymeras togs bort. I och med att man bytte ut E. coli polymeraset mot Taq blev även säkerheten större med testerna. Användningsmöjligheterna ökade och man kunde nu t ex amplifiera längre och känsligare sekvenser.


Vad är nukleotider?

De är ”bokstäverna” i DNA, T, A, G och C.


Vad är det viktigaste i PCR?

Att primerna är rätt designade. Dessa är oligonukleotider som har specifika bindningsställen på DNA-strängen (template). Primern binder till en sekvens precis framför den sökta genen. Polymeraset Taq binder sedan till primern och börjar avläsningen där. Primer och template behöver inte matcha helt, bara en stabil bindning bildas. Primern ska vara så kallad komplementär till sekvensen. Den totala storleken på DNA-fragmentet som ska amplifieras bör inte vara mindre än 1 kilobaser (kb) men inte heller överskrida 3 kb för att ett bra resultat ska uppnås. Det är möjligt att amplifiera fragment upp till 40 kb, men då måste speciella metoder användas. Längden på primer spelar en betydande roll om försöket ska lyckas eller inte. Är primers för korta leder detta till att de blir komplementära till många fler sekvenser på genomet. Då amplifieras flera olika, oönskade fragment samt det som söktes. Detta gör det omöjligt att lokalisera det eftertraktade fragmentet. Är däremot primers för långa innebär det att de binder långsammare till den komplementära strängen. Detta leder till att PCR-metoden inte kan amplifiera tillräckligt många DNA-molekyler och resultatet blir inte korrekt. Den optimala längden på primern är 17 nukleotider. Med 17 nukleotider är primern tillräckligt lång för att bara matcha på endast en plats i genomet och är tillräckligt kort för att kunna hybridiseras .


Vad sker i första steget?

Första steget, denaturering, hettas blandningen upp till mellan 90˚ och 96˚ C. Vid den temperaturen delas den dubbelsträngade DNA-molekylen till två enkelsträngar. Det tar ca 1 min. Vid en temperatur på ca 94 °C så smälter vätebindningarna mellan den dubbelsträngade DNA-molekylen och enkelsträngat DNA bildas. Alla enzymreaktioner upphör att fungera på grund av den höga temperaturen. Körs under ca en minut.


Vad sker i andra steget?

Andra steget, hybridization eller annealing, fäster primrarna på passande ställe på DNA. T mot A, och G mot C. Polymeraste fäster sig sedan på den stabila bindning som bildats och börjar kopiera DNA-sekvensen. Temperaturen här är ungefär 54 – 60 C och tar ca 1 min.
De enkelsträngade primers, som tillsattes innan försöket påbörjades, bildar vätebindningar med de enkelsträngade DNA-molekylerna. Annealingen har en arbetstemperatur på ca 54 °C och pågår i en minut. Molekylerna bryts och bildas oavbrutet beroende på hur stabila de är. Har primern hittat en komplementär sekvens bildas en stabil bindning. Där fäster sedan polymeraset och börjar kopiera DNA-sekvensen.


Vad sker i tredje steget?

Tredje steget, extension, skall temperaturen höjas till 72 C och tar ca 2 min. De primers som blivit över bryts ner p.g.a. temperaturen och Taq arbetar bra eftersom den tål höga temperaturer. Extensionen fortgår i ca två minuter. Vid ca 72 °C arbetar polymeraset som bäst. De primers som inte bundit med alla nukleotider under annealing steget bryts i detta steg sönder på grund av den högre temperaturen. Endast de primers som bundit exakt med DNA-sekvensen kopieras. Polymeraset som används i PCR kommer från bakterien Thermus aquaticus (Taq). Dess unika egenskap är att den utan problem kan arbeta effektivt i höga temperaturer.


Hur länge upprepas de tre stegen?

De upprepas så länge tills man fått så mycket DNA som man behöver. Själva cykeln består av tre olika delmoment. Denna cykel körs normalt sett i 30-40 gånger för att man ska få tillräcklig stor mängd DNA. DNA ökar exponentiellt i varje cykel och vid slutet av PCR har man fått en mycket större mängd DNA än det man startade med. Ett helt program bestående av ca 35 cyklar tar ungefär 1,5 till 2 timmar.


Hur kontrollerar man resultatet?

Innan man kan använda produkterna från PCR är det viktigt att man kontrollerar att försöket verkligen har lyckats. Produkterna kontrolleras antingen genom gelelektrofores, direkt sekvensering av produkten eller så klonar man PCR-produkten. Följande villkor måste vara uppfyllda:
1) En produkt har bildats. Även om metoden är väl utarbetad och kontrollerad, är det inte säkert att PCR varje gång lyckas med att bilda en produkt. DNA som användes kan ha varit för dålig eller så passade kanske primern inte in.
2) Produkten har rätt storlek. Det kan t ex hända att man får en produkt som är ca 400 baspar (bp) lång, när det förväntade resultatet var 1600 bp. Detta kan bero på felkonstruktion av primers.
3) Rätt antal band på elektroforesen syns. Ibland kan primers binda till fler än den önskade sekvensen vilket leder till flera band blir synliga än de väntade resultatet.
Som hjälp vid analys av produkterna har man en allelic ladder. Denna tillsätts i en egen brunn och visar bestämda band på gelen som man kan använda som storlekskontroll på sina egna prover.

PCR har minskat arbetsbördan åt forskarna. Genom att blanda enzymet (polymeraset) plus det DNA man vill amplifiera och sedan köra ett PCR-program kan man få DNA att exponentiellt växa genom en cykel av olika temperaturhöjningar och sänkningar, den så kallade chain reaction.
Det som slog de flesta med häpnad var att PCR-metoden var så enkel. Det förvånade forskare världen över att ingen hade tänkt på det tidigare. Temperaturen som används vid annealingen spelar en stor roll om hur stor specificering försöket ska ha. Är temperaturen för låg binder primers vid för många ställen och leder till att en för stor mängd sekvenser amplifierade eftersom primers kan bilda stabila bindningar med icke-komplementära sekvenser. Är däremot temperaturen för hög bildas inga bindningar alls, utan primers och DNA-strängar fortsätter vara obundna. Så den ideala temperaturen för annealing steget måste vara tillräckligt hög för att förhindra bindningar mellan primers och icke-önskade sekvenser, men tillräckligt låg för att primers ska ha en chans att binda till de komplementära sekvenserna.

För att räkna ut denna perfekta temperaturen använder man sig av smälttemperaturen (Tm) för varje primer–template hybrid. Smälttemperaturen anger vid vilken temperatur som bindningarna mellan dessa kommer att smälta. Om man sedan lägger annealing temperaturen en till två grader under denna får man en lagom temperatur. När man vill räkna ut smälttemperaturen använder man sig av en enkel formel baserad på hur många och vilka nukleotider primern består av.

Tm = (4 x [G + C] ) + ( 2 x [A + T] )
<...