GMO i livsmedel

Inledning

Syftet med laborationen är att undersöka förekomsten av genmodifierade organismer i sojasås och tortillas. Anledningen till att dessa två livsmedel testas är för att de innehåller sojabönor respektive majs - ingredienser kända för att existera som genmodifierade grödor. Livsmedlena i fråga är inte märkta som genmodifierade då mängden är så liten att ingen specifik varumärkning krävs. Det betyder inte nödvändigtvis att de inte innehåller genmodifierade organismer[1]. Förutom genmodifierat DNA är det möjligt att livsmedlena innehåller kloroplast DNA, kloroplast DNA testas för att stärka eventuell bevisning för att inget rekombinant DNA finns. Finns varken kloroplast eller genmodifierat DNA är det möjligt att inget DNA finns eller att extraktion av DNA misslyckats.

I en genmodifierad organism har en så kallad transgen rekombinerats med organismens ordinarie genom för att på så sätt ge avkomma vars genom innehåller transgenen. Transgener för grödor brukar innefatta sådana som ger resistens mot sjukdomar och insektsangrepp eller sådana som generellt ger mer avkastning eller enklare bearbetning. Nästan alla genmodifierade organismer innehåller en 35 S promotor utvunnet från Cauliflower Mosaic Virus och en nos terminator för transkription. 35S sekvensen finns på sense strand med riktningen 5' till 3', därför har man namngett denna promotor till 5'35S promotorn. Denna promotors sekvens är känd varvid primers (sense och antisense) kan syntetiseras som binder till denna specifika sekvens för genmodifierade organismer.

Vid genmodifiering av växter används Ti-plasmider i Agrobacterium tumefaciens som vektorer. TDNA är en del av Ti plasmiden och kodar för enzymer som syntetiserar bl.a. Auxin samt Cytokinin och är den del som rekombineras in i växten. Närvaron av Auxin och Cytokinin innebär att det vid translation av trangenen bildas en tumör, dessa tumörceller kan sedan genom induktion från de "normala" cellerna differentieras till en planta. De fröämnen som sedan bildas innehåller det rekombinerade Ds-DNA:et.

Mängden DNA hos livsmedlena kommer att amplifieras med hjälp av PCR. PCR är en metod där en sekvens DNA kan masskopieras i en metod liknande DNA replikation. Istället för olika DNA polymeras används Taq-polymeras som tål höga temperaturer. PCR involverar tre huvudsteg: Denaturering, Hybridisering samt Polymerisation.

Då det finns både kloroplast och genmodifierat DNA kommer två olika sorters sense och antisense primers som binder till varsin strand vid dessa DNA molekyler att utnyttjas. Den ena är 5'35S som binder till 35S promotorn, den andra binder till kloroplast DNA. Teorin bakom analyseringen av resultaten bygger därför på att vid förekomst av endast Kloroplast DNA kommer 5'35S inte att binda och vice versa. Med hjälp av gelelektrofores kan sedan eventuell förekomst av primers som ej har bundits påvisas, och motbevisa förekomsten av någon av de två DNA typerna.

Gelelektrofores sker med hjälp av en agarosgel bestående av en buffert samt agaros, vars koncentration gentemot bufferten dikteras av längden hos DNA molekylerna. Gelen består i stort sett av polymerer bundna till varandra och hindrar de negativt laddade DNA molekylernas gång från katod till anod med avseende på molekylernas storlek. För denna laboration kommer DNA molekyler upp till 300bp att testas vilket medför en koncentration av 2 % hos gelen.

GelGreen som används för färgning av DNA är inte radioaktivt och stabilt i förhållande till temperatur och vatten. GelGreen är inte optimalt när gelen består av polyakrylamid på grund av GelGreen långsamma diffusion, därför används Agar.

Metod

För metod se bilaga.

Resultat
Arghh bilden kom inte med!

Figur 3: Bild på gel efter gelelektrofores med de olika proverna samt kontroller och stegen markerade.

Figur 1: Tabell över Resultat av gelektrofores med prover som genomgått PCR med 5'35S sense och antisense primers.

Figur 2: Tabell över resultat av gelelektrofores med prover som genomgått PCR med Kloroplast sense och antisense primers.

Diskussion

Vi kan börja med att konstatera att positiv kontroll med 5´35S har markeringar på 145 och 27bp. Men eftersom att kvävebaser tillsattes i överflöd i alla prov vid PCR kan den kortaste sekvensen inte vara 5´35S primern. Den positiva kontrollen innebär också att primers deltagit i reaktionen och förbrukats. Dessutom har testerna med kloroplastprimers markeringar vid samma avstånd trots att ingen 5´35S primers tillsattes vid dessa. Markeringar kring 27 måste vara de överflödiga basparen trots att de egentligen bör markeras som 1-2bp långa. Den förskjutna markeringen beror troligtvis på en felande stege. Stegen påverkar dock inte resultaten eftersom att proverna relateras med varandra men det innebär att ingen riktig längd i bp kan anges.

Om man jämför den negativa kontrollen med kloroplastprimers, med Tortilla och kloroplastprimers ser man att markeringarna inte stämmer väl överens dem emellan. Eftersom att markeringen vid 32 bp hos negativa kontrollen med kloroplast var överblivna baspar är det troligt att markeringen vid 65bp är primers. Om det inte finns primers hos provet med Tortilla betyder det att kloroplastprimers har reagerat i PCR, vilket stärks av markeringen vid 142 bp. Tortilla innehåller alltså kloroplast DNA.

Gör man samma jämförelse fast med provet med Soja och kloroplastprimers ser man att provet Soja har markering kring 54 bp vilket är snarlikt 65 bp och som alltså troligtvis är primers. Alltså innehåller Soja inte kloroplast DNA.

Brunnen med Tortilla och Soja tillsammans 5'35S primers har markeringar för primers som överrensstämmer med Negativa kontrollen med 5'35S primer (alla är 51-61 bp långa). Vi kan dra slutsatsen att inga 5'35S primers har reagerat i PCR. Däremot kan vi inte säga att ingen promotor finns hos dessa prover och inte heller att de inte är genmodifierade. För om soja varken hade kloroplast eller Genmodifierat DNA kan det enligt inledningen bero på att inget DNA finns i de undersökta livsmedlena eller att extraktion av DNA misslyckats därför kan inget sägas om förekomsten av genmodifierat DNA i soja.

Slutsats

Tortilla innehöll inte genmodifierat DNA men dock Kloroplast DNA.

Källor

Pontoppidan M. GMO i livsmedel. Katedralskolan 2008

Farrel. O. S. / Campbell K. M. Biochemistry. Thomson Learning 2003 U.S.A

Bilaga

Metod

Extraktion av DNA ur livsmedlet

En cirka kubikcentimeter stor bit av vardera tre livsmedel utom sojan mortlades i en kyld mortel tills de blev pulveriserade/mosade varvid varje prov blandades med 1.5 μl kylt vatten. 50 μl av vätskan av vardera tre blandningar överfördes sedan med en plastpipett till varsitt eppendorfrör innehållandes chelex och blandades med en vortex. Proverna inkuberades i 10 min i kikande vattenbad och kyldes därefter på is i cirka 1 min. Röret centrifugerades sedan i mikrocentrifug. 100 μl av supernatanten överfördes från varje eppendorfrör till ett nytt.

PCR

Alla proven i de tre eppendorfrören överfördes till vardera två PCR rör innehållandes 12.5 μl REDTaq Mix. 6μl sterilt vatten tillsattes i alla de 6 PCR rören. 2 μl primer samt 2 μl antisenseprimer av antingen 5'35S-primertyp eller kloroplastprimertyp tillsattes i de 6 PCR rören på så sätt att varje prov blandades med båda av primertypen. Rören sattes sedan ner i PCR maskinen varvid PCR kördes.

Tabell över tillsatser i PCR rören, DNA ur prov är DNA extraherat från livsmedlena.

Tabell över program för termocykler i PCR, antal cykler = 40, slutförlängning i 3min vid 72?

Gjutning av 40ml gel massprocent 2%

40 ml buffert tillsattes i en 100ml flaska med kork, 0.8 gram agaros tillsa...